| Главная » Файлы » Мои файлы |
ЗВІТ з дисципліни «Основи наукових досліджень» на тему: Ферментні комплекси Alicyclobacillus acidocaldarius
| [ Скачать с сервера (176.8 Kb) ] | 24.05.2017, 01:19 |
| Останніми роками у світі спостерігається зростання інтересу до термоацидостабільних ферментів, особливо класу гідролаз. Це зумовлено технологічною необхідністю: на багатьох виробництвах умови проведення технологічного процесу досить жорсткі [1, 2, 3]. Так, наприклад, виробництво біоетанолу включає стадію доферментаційної підготовки рослинної сировини, яка для успішної біоконверсії повинна бути деполімеризована до моно- та олігосахаридів [4, 5, 6]. Фізико-хімічний гідроліз целюлози є енергозатратним (проводиться за високих температур і тисків), а тому економічно невигідним процесом. Більш того, нерідко він призводить до утворення екологічно небезпечних відходів. Тому перспективним напрямом вдосконалення технології є використання ферментативного гідролізу, для чого застосовуються целюлолітичні ферменти [1, 4, 5]. Найпопулярнішим промисловим продуцентом целюлаз на сьогодні є мікроміцет Trichoderma reesei. Однак цей гриб є мезофільним, і його ферменти, відповідно, мають оптимум дії в області помірних температур та нейтрального рН [7], що не відповідає вимогам згаданої технології. Одними з перспективних продуцентів термоацидотолерантних целюлаз є бактерії Alicyclobacillus acidocaldarius. Вони синтезують складний целюлолітичний комплекс, ферменти якого не втрачають активності при нагріванні до 80 oC та рН<2 [8, 9]. Крім цього, у літературних джерелах є свідчення про існування у цих бактерій амілаз та протеаз із тими ж властивостями [10-14]. Дана робота присвячена характеристиці основних ферментів A. acidocaldarius. РОЗДІЛ 1. ЦЕЛЮЛОЛІТИЧНИЙ КОМПЛЕКС 1.1. Загальна характеристика ферменту і субстрату Целюлаза (КФ 3.2.1.4) являє собою комплекс гідролітичних ферментів, спільна дія яких розкладає целюлозу до мономеру – β-глюкози. В окремих випадках вони можуть також гідролізувати похідні целюлози – карбоксиметилцелюлозу, геміцелюлозу, лігноцелюлозу тощо; такі ферменти називаються геміцелюлазами [15]. Їх присутність у загальному комплексі дозволяє гідролізувати не лише чисту целюлозу, але і рослинну біомасу. Біомаса рослин складається з чотирьох основних компонентів: целюлози, геміцелюлози, лігніну та пектину; разом вони називаються лігноцелюлозою. Структурне взаєморозміщення цих чотирьох компонентів у клітинній стінці рослин наступне: целюлозні волокна пронизують та укріплюють матрицю з геміцелюлози і лігніну або пектину (рис. 1.1.) [16, 17]. Кристалічність целюлози, гідрофобність лігніну та інкапсульованість целюлози всередині лігнін-геміцелюлозної матриці є основними факторами, що визначають стійкість рослинних матеріалів до біологічного руйнування [18]. Щоб отримати доступ до целюлози, потрібно спочатку зруйнувати всі супутні їй сполуки. Саме цим визначається цінність геміцелюлаз у складі ферментного комплексу. Рис. 1.1. Лігноцелюлозна структура волокна клітинної стінки Основними ферментами целюлолітичного комплексу є: 1) екзоцелюлази – гідролізують нерозчинні целюлозні субстрати з невпорядкованим β-1,4-зв’язків у молекулі целюлози; 2) ендоцелюлази – гідролізують розчинні целюлозні субстрати з розривом β-1,4-зв’язків у будь-якому місці полімерного ланцюга; 3) β-глюкозидази, целобіази – гідролізують целобіозу та інші β-глюкозиди [19, 20]. 1.2. Ферментний комплекс A. acidocaldarius Вивчення целюлолітичних властивостей A. acidocaldarius провадиться з 80-х рр. ХХ ст. [21]. Станом на 2012 р. у A.acidocaldarius ідентифіковано наступні термоацидостабільні ферменти целюлазного комплексу: [3] - 1,4-β-D-глюкан-4-глюканогідролаза (ендоглюканаза); - целобіогідролаза; - целобіозофосфорилаза; - α-глюкозидаза; - β-глюкозидаза; - α-галактозидаза; - β-галактозидаза; - β-1,4-ксиланаза; - α-ксилозидаза; - α-L-арабінофуранозидаза. Промислове значення можуть мати наступні ферменти: 1) ендоглюканаза CelA Оптимум дії 70 оС, рН=5,5; не виділяється в культуральну рідину. Стабільна при зберіганні в буферному розчині за 4 оС, зберігає 50% активності при нагріванні до 80 оС. Специфічна до β-1,4-глюканів. Амінокислотна послідовність білка (GenBank: CAC34051.1) та нуклеотидна послідовність гена, що його кодує (GenBank: AJ308623.1), охарактеризована у статті [22]. Амінокислотна послідовність: 1 mpsrvpksif ynqvgylisg dkrfwiqahe pqpfalrtpe gqavfagmtk pvggnwyvgd 61 ftalrvpgty tltvgtlear vvihrrayrd vleamlrffd yqlcgvvlpe deagpwahga 121 chtsdakvfg teralacpgg whdagdygky tvpaakavad lllaheyfpa alahvrpmrs 181 vhraphlppa levareeiaw lltmqdpatg gvyhkvttps fppldtrped ddaplvlspi 241 syaatatfca amahaalvyr pfdpalsscc adaarrayaw lgahemqpfh npdgiltgey 301 gdaelrdell wascallrmt gdsawarvce plldldlpwe lgwadvalyg vmdylrtpra 361 avsddvrnkv ksrllrelda laamaeshpf gipmrdddfi wgsnmvllnr amafllaegv 421 gvlhpaahtv aqraadylfg anplgqcyvt gfgqrpvrhp hhrpsvaddv dhpvpgmvvg 481 gpnrhlqdei araqlagrpa meayidhqds ystnevavyw nspavfviaa lleargr Нуклеотидна послідовність гена, що кодує фермент CelA: 1 cggtgccggc cgacgttcgc ggcgcgcgcg cgggtcgcca tcgagcggat ggtggccatc 61 ggctgacgtc gagaggcgga ggcaggtatc ggcacgcgag gcgtcgaatc ctctctcctg 121 caagccggtg ggaggggatt cgacatgccg tctcgcgtgc ccaaatcgat tttttataat 181 caagttgggt atctgatcag cggcgacaag cgcttttgga ttcaggctca cgagcctcag 241 cctttcgcgc tgcgcacgcc ggaagggcag gccgtgttcg cgggaatgac gaagcccgtc 301 ggcgggaatt ggtacgtcgg cgattttacc gcgcttcgcg tgccggggac ctacacgttg 361 acggtaggga ctctcgaggc gcgggtcgtt atccatcgcc gcgcgtatcg tgacgtgctc 421 gaggccatgc tgcgcttctt cgactatcag ctctgcggcg tcgtgctgcc cgaggatgaa 481 gccgggccgt gggcgcacgg cgcctgtcac acgagcgacg ccaaggtgtt tggcaccgag 541 cgcgccttgg cctgcccagg cggttggcac gacgctggcg attacggcaa atacacggtc 601 cccgccgcca aggccgtggc cgatctcctg ctcgcccacg agtacttccc ggcggcactg 661 gcgcacgtcc gccccatgcg ctcggtgcat cgggcgcctc atctgccgcc ggcgctcgag 721 gtggcgcgcg aggagattgc ctggcttctc accatgcagg atcccgcgac aggcggcgtg 781 taccacaaag tcaccacgcc ttcctttccg ccgctcgaca cgcgccccga agacgacgat 841 gcgcccctcg tcctcagtcc catctcctac gccgccacgg ccacgttttg cgccgccatg 901 gcgcatgccg ccctggtgta ccgccctttc gatccggccc tatcctcgtg ctgtgcggac 961 gccgcccgtc gcgcgtacgc gtggctcggc gcgcacgaga tgcagccgtt tcacaatccc 1021 gatgggatcc tcacgggcga atacggcgac gcggaactcc gcgacgagct gttgtgggcg 1081 tcctgcgccc tgcttcgcat gaccggcgat tccgcgtggg cacgcgtgtg cgagccgctt 1141 ctcgatctcg acctcccgtg ggagttggga tgggcggacg tcgcactcta cggcgtcatg 1201 gattacctgc gcactccgcg cgccgccgta tcggacgacg tgcgaaacaa ggtgaaaagc 1261 cgccttctcc gagaactcga cgccctcgcc gcgatggctg agtcgcatcc gttcggcatt 1321 cccatgcggg atgacgattt catctggggc agcaacatgg tgctcttgaa ccgcgccatg 1381 gcgttcctgc tggccgaagg cgtcggtgtc cttcatcccg ctgcacatac ggtggcccag 1441 cgcgcggcgg actacctgtt tggcgcaaat ccgctcgggc agtgctacgt cacgggcttt 1501 ggccaacgcc ccgtgcgcca tccgcatcat cgcccgtccg tcgcggatga tgtggaccat 1561 cccgtccctg gcatggtcgt cggcggccca aaccgccacc tgcaggacga gatcgcccgc 1621 gcacagcttg cggggagacc tgcgatggag gcgtacatcg atcaccagga cagctactcg 1681 accaacgagg tcgccgtcta ctggaattcg cctgccgtgt ttgtcatcgc ggctttgctc 1741 gaggcgcgcg ggaggtgacg gatggctttc caggcaca 2) ендоглюканаза Cel9A Оптимум дії такий же, як і в попереднього ферменту. Однак, на відміну від нього, діє і на β-1,4-ксилани. Амінокислотна послідовність білка (PDB: 3EZ8_A) охарактеризована у статті [23]. У складі молекули наявні імуноглобуліноподібний та каталітичний модулі. Біля активного центру розміщено 2 іони кальцію та 1 іон цинку [23, 26] (рис. 1.2). Рис. 1.2. Модульна архітектура ендоглюканази Cel9A. Амінокислотна послідовність: 1 mpsrvpksif ynqvgylisg dkrfwiqahe pqpfalrtpe gqavfagmtk pvggnwyvgd 61 ftalrvpgty tltvgtlear vvihrrayrd vleamlrffd yqlcgvvlpe deagpwahga 121 chtsdakvfg teralacpgg whdagdygky tvpaakavad lllaheyfpa alahvrpmrs 181 vhraphlppa levareeiaw lltmqdpatg gvyhkvttps fppldtrped ddaplvlspi 241 syaatatfca amahaalvyr pfdpalsscc adaarrayaw lgahemqpfh npdgiltgey 301 gdaelrdell wascallrmt gdsawarvce plldldlpwe lgwadvalyg vmdylrtpra 361 avsddvrnkv ksrllrelda laamaeshpf gipmrdddfi wgsnmvllnr amafllaegv 421 gvlhpaahtv aqraadylfg anplgqcyvt gfgqrpvrhp hhrpsvaddv dhpvpgmvvg 481 gpnrhlqdei araqlagrpa meayidhqds ystnevavyw nspavfviaa lleargr 3) ендоглюканаза CelВ Оптимум дії 80 оС, рН=4; деякий час не втрачає активності при температурах від 40 до 100 оС та значеннях рН від 3 до 5. Специфічна до глюканів та ксиланів. Легко виділяється з клітин екстрактивними методами. Амінокислотна послідовність білка (GenBank: CAD86595.1) та нуклеотидна послідовність гена, що його кодує (GenBank: AJ551527.1) описані у статті [9]. Амінокислотна послідовність: 1 mkrpwsaala alialgtgas pawaaahpsp kvpagaagrv raadvvstpi smeiqvihda 61 ltvpelaavq aaaqaasnls tsqwlqwlyp natpttsaqs qaaqavanlf nlatygavst 121 rgsnaaqilq tlqsisplls pravglfyqs flteigqssk ailarqasss ivgnalaqaa 181 slsptisayl rqnglspsdl artwssfetq vdpqgaaqta latrictnal gfgaptasat 241 itvntaarlr tvpatafgln aavwdsglns qtvisevqal hpalirwpgg sisdvynwet 301 ntrndggyvn pndtfdnfmq fvnavgaspi itvnygtgtp qlaadwvkya dvthhdnvly 361 weigneiygn gyyngngwea ddhavpnqpq kgnpglspqa yaqnalqfiq amravdpnik 421 igavltmpyn wpwgatvngn ddwntvvlka lgpyidfvdv hwypetpgqe tdaglladtd 481 qipamvaelk reinayagsn akniqifvte tnsvsynpgq qstnlpealf laddlagfvq 541 agaanvdwwd llngaednyt spslygqnlf gdygllssgq atpkgvqepp qytplppyyg 601 fqlvsdfarp gdtllgsass qsdidvhavr epngdialml vnrspstiys adlnvlgvgp 661 yaitkalvyg egssavspal tlptahsvkl mpysgvdlvl hplipaphaa asvtdtlals 721 sptvtaggse tvtasfssdr pvrdatvele lydstgdlva nhemtgvdia pgqpvseswt 781 faapaangty tveafafdpa tgatydadtt gatitvnqpp aakygdivtk ntvitvngtt 841 ytvpapdasg hypsgtnisi apgdtvtiqt tfanvsstda lqnglidmev dgqngaifqk 901 ywpsttllpg qtetvtatwq vpssvsagty plnfqafdts nwtgncyftn ggvvnfvvn Нуклеотидна послідовність гена, що кодує фермент CelВ: 1 cattgacatt atagacaacc gacgctataa cgaaagtaaa tcgattttac taaatcgttt 61 tgaagttcat gaaaccgctt tctctgtgga gggatcgcct tgaagagacc ttggtctgct 121 gcgctggccg cactcatcgc gctgggaacc ggcgcgtcgc ccgcgtgggc cgccgcccat 181 ccgtcgccga aagtacctgc aggagccgcc ggccgcgtgc gcgccgccga cgtcgtgtcg 241 acgccgattt cgatggagat ccaggtgatt catgacgcgc tcacggtgcc cgagctcgcc 301 gccgtccagg ccgcagcgca ggcagcgtcc aacctgtcga catcgcagtg gctccagtgg 361 ctgtatccga atgccacgcc gacgacgagc gcgcagtccc aggctgcgca ggccgtcgcc 421 aacctgttca acctggccac atacggcgct gtatcgaccc gcgggagcaa cgccgcgcag 481 attttacaga cgcttcagtc catttctccc ttgctctcgc cgcgcgccgt tggcctcttc 541 tatcaatcgt ttttgaccga gatcggccaa tcgtccaaag ccatcttggc ccgccaagcc 601 tctagctcca ttgtcggcaa cgcgctcgcg caggccgcgt cgctctcgcc caccatctcc 661 gcctacctgc gccagaacgg gctgtctccg tccgatctcg cccgcacctg gtcgagcttt 721 gaaacgcagg tcgacccgca gggcgccgcg cagaccgcgc tcgcgacccg catctgcacg 781 aacgcgctcg gcttcggcgc gcccaccgcc agcgccacca tcaccgtgaa cactgccgcc 841 cgcctccgga ccgttcctgc caccgccttt gggctgaacg cggccgtgtg ggacagcggg 901 ctcaactcgc agaccgtcat ctccgaggtg caggcgctcc atcccgcgct catccgctgg 961 cccggcggct ccatctcgga cgtgtacaac tgggagacca acacgcgcaa cgacggcggc 1021 tacgtcaacc ccaacgacac gtttgacaac ttcatgcagt tcgtgaacgc cgtgggcgcc 1081 tcgcccatca tcaccgtcaa ctacggcacc ggcacgcccc agctcgcggc cgactgggtc 1141 aagtacgccg acgtcaccca tcacgacaac gtcctatact gggaaatcgg caacgagatc 1201 tacgggaacg gctactacaa cggcaacggc tgggaagcgg acgatcacgc cgtcccgaac 1261 caaccgcaga aaggtaaccc cggcctgagc ccgcaggctt acgcgcagaa cgccctgcag 1321 ttcatccagg ccatgcgcgc cgtcgatccc aacatcaaaa tcggcgcggt gctcaccatg 1381 ccgtacaact ggccctgggg cgccaccgtg aacggcaacg acgactggaa cacggtcgtg 1441 ctcaaggcgc tcggcccata catcgacttc gtcgacgtgc actggtaccc ggagaccccc 1501 ggccaggaga ccgacgccgg gctcctcgcc gacacggatc agatccccgc catggtggcg 1561 gagctcaagc gcgagatcaa cgcgtacgcc ggatcgaacg caaaaaatat ccaaatcttc 1621 gtgaccgaga ccaacagcgt gtcctacaac ccggggcagc agtcgacgaa tctgcccgag 1681 gcactctttt tggcggacga tctcgccggc ttcgtgcagg cgggcgcggc caacgtcgac 1741 tggtgggacc tcctgaacgg cgccgaggac aactacacga gtccgagcct ctacggccag 1801 aacctgtttg gcgattacgg gctgctgtcg tccgggcagg ccacgcccaa gggcgtccag 1861 gagccgcctc aatacacccc gctgccgccg tactacggct tccagctcgt gtccgacttc 1921 gcgcggccgg gtgacaccct cctgggctcc gcctcttccc agagcgacat cgacgtgcac 1981 gcggtgcggg agcccaacgg cgacatcgcc ctgatgctcg tgaaccgcag tccgtcgacc 2041 atctacagcg cagatctgaa cgtgctcggc gtgggaccgt acgccatcac caaggcgctc 2101 gtgtacggcg aaggctcgag cgcggttagc ccagcgctga cgctgccaac cgcccactcg 2161 gtcaaactca tgccgtacag cggcgtggat ctcgtcctgc acccgctcat ccccgcgccg 2221 cacgccgctg cgtcggtgac ggacaccttg gcgctctcct cgcctaccgt gaccgccggc 2281 ggctccgaga ccgtcaccgc gtcgttcagc tcggataggc ccgtacgcga tgcgacggtg 2341 gaactcgagc tgtacgattc gacgggcgat ctcgtcgcga atcacgaaat gacgggcgtg 2401 gatatcgcgc caggccagcc ggtgagcgaa tcctggacct ttgcggcccc ggccgccaac 2461 gggacctaca ccgtcgaggc gttcgccttc gatccggcca caggcgccac gtacgacgcc 2521 gatacgacgg gcgcgaccat caccgtgaat cagcctcccg cagccaagta cggcgacatt 2581 gtcacaaaga acacggtcat cacggtgaac ggcaccacgt acaccgtgcc cgcgcctgac 2641 gcaagtggcc actatccgtc gggaaccaac atctccattg cgccgggtga cacggtcacc 2701 atccagacca cgttcgccaa cgtctcgtcg accgacgcgc tccagaacgg gctcatcgac 2761 atggaggtgg acgggcaaaa cggcgctatc ttccaaaagt actggccgag caccacgctc 2821 cttcccggcc agaccgagac cgtgaccgcc acctggcagg tgccgtcatc ggtgagcgca 2881 ggcacgtatc cgctcaactt ccaggcgttt gacacgagca actggacggg caactgttac 2941 ttcaccaacg gcggcgtggt caactttgtg gtgaactga 4) β-1,4-глюканаза CelA4 Оптимум дії 65 оС, рН=2,6. Має широку субстратну специфічність, протеазорезистентна, більш стабільна, ніж існуючі препарати подібних ферментів. [8] 5) целюлаза CelG Оптимум дії 65 оС, рН=4. [24] 6) β-глюкозидаза Оптимум дії 85 оС, рН=5,5. Не втрачає активності при температурі 65 оС (хоча при 80 та 90 оС деактивується практично відразу) та значеннях рН від 4 до 6. Субстратна специфічність широка: фермент виявляє активність до β-D-глюко-, галакто- та фукозидів, глюкозодисахаридів (целобіози, гентіобіози), здатен досить ефективно розкладати лактозу. Амінокислотна послідовність білка (GenBank: AAZ81839.1) охарактеризована у статті [25]. | |
| Просмотров: 497 | Загрузок: 14 | Рейтинг: 0.0/0 | |
| Всего комментариев: 0 | |