| Главная » Файлы » Мои файлы |
ЕФЕКТИ ВІТАМІНІВ D3 ТА Е
| [ Скачать с сервера (1.01 Mb) ] | 13.05.2017, 14:41 |
| ПЛАН ВСТУП……………………………………………………………...……3 РОЗДІЛ 1. Постановка експерименту та методи досліджень………....5 1.1. Визначення фагоцитарної активності клітин крові щурів………5 1.2. Тест відновлення нітросинього тетразолію…………………….6 1.3. Флюоресцентне визначення рівня утворення активних форм кисню та азоту з DCF-DA……………………………………….6 РОЗДІЛ 2. Аналіз отриманих результатів……………………………....8 2.1. Визначення вмісту 25(ОН)3………………………………………....8 2.2. Фагоцитарна активність (Phagotest)……………………………..….8 2.3. Визначення метаболічної активності нейтрофілів (НСТ-тест)…....9 2.4. DCF-чутливе утворення активних форм кисню та азоту………..…10 ВИСНОВКИ…………………………………………………………….…12 СПИСОК ЛІТЕРАТУРНИХ ДЖЕРЕЛ………………………………......13 ДОДАТКИ………………………………………………………………....15 ВСТУП Як відомо, глюкокортикоїди є високоефективними протизапальними засобами, які знаходять широке застосування у медичній практиці. Ключові механізми їх протизапальної дії пов’язані зі зниженням активності фосфоліпази А2, пригніченням ліберації арахідонової кислоти та блокуванням утворення простагландинів і лейкотрієнів. Крім того, глюкокортикоїди стабілізують цитоплазматичні мембрани та мембрани лізосом, зменшують проникність капілярів, гальмують міграцію нейтрофілів та макрофагів до осередків запалення, а також їхню фагоцитарну активність, пригнічують проліферацію фібробластів і синтез колагену. Відомо, що при тривалому застосуванні та у високих дозах глюкокортикоїди проявляють побічні ефекти, виступаючи як імунодепресанти, здатні знижувати функціональну активність нейтрофілів і моноцитів, викликати лімфопенію та пригнічувати клітинні імунологічні реакції . Це підвищує схильність організму до різних бактеріальних, грибкових, вірусних і паразитарних інфекцій. Крім того, глюкокортикоїди при тривалому застосуванні інгібують синтетичну активність остеобластів, що призводить до розвитку остеопорозу. Наявність ознак вторинного імунодефіциту, спричинених хронічним впливом глюкокортикоїдів на організм, спонукає до пошуку ефективних засобів корекції зазначених імунних порушень. Враховуючи значне ураження клітинного імунітету і фагоцитарної системи у хворих, які тривалий час знаходяться на глюкокортикоїдної терапії, перспективним є застосування імуномодуляторів, основна дія яких спрямована на активацію клітин-мішеней мікрофагальної системи. Останнім часом значна увага приділяється науковому обгрунтуванню можливості ефективного застосування вітаміну D3 та його гормонально активних похідних для зняття побічних ефектів глюкокортикоїдів. Однак залишається нез’ясованою дія гормонально активних форм вітаміну D3 на фагоцитарну ланку імунної відповіді, особливо приймаючи до уваги здатність цих сполук проявляти як імуностимуляторні, так і імунодепресивні ефекти. Дане дослідження було проведено з метою оцінки ефективності застосування вітаміну D3 у корекції порушень фагоцитарної активності та кисеньзалежної мікробіцидності фагоцитуючих клітин периферичної крові щурів, викликаних синтетичним глюкокортикоїдом преднізолоном. РОЗДІЛ 1. Постановка експерименту та методи дослідження 1. Визначення фагоцитарної активності клітин крові щурів Всі експерименти проводили на щурах-самцях лінії Wistar з масою тіла 100±5г. Досліджувані препарати (преднізолон, вітаміни D3 та Е) вводили один раз на добу у дозах 0,5 мг, 100 МО і 7,26 МО відповідно упродовж 30 діб внутрішньошлунково за допомогою зонду. Для оцінки стану метаболізму вітаміну D3 визначали в сироватці крові основний метаболіт вітаміну D3 — 25 гідроксивітамін D3 (25(ОН)D3). Концентрацію цього метаболіту у сироватці крові визначали імуноферментним методом за допомогою набору «25-OH-Vitamin D3» комерційної фірми «Immundiag». Фагоцитоз (поглинання бактерій нейтрофільними гранулоцитами та моноцитами) визначали за допомогою комерційного набору PHAGOTEST на протоковому цитофлуориметрі Beckman Coulfer Epics XL (рис 1А). До гепарінізованої цільної крові (0,1 мл) вносили Esherichia coli, мічені FITС (флуоресцентна мітка) та інкубували при температурі +37ºС упродовж 10 хв. Фагоцитоз зупиняли розміщенням зразків на льоду та додаванням реагенту для гасіння флуоресценції тих бактерій, що зв’язались з поверхнею фагоцитів, але не поглинулись ними. Після двохразової відмивки PBS (фосфатно-сольовим буфером) (рН 7,4), до зразків додавали лізуючий розчин для руйнування та видалення еритроцитів. Безпосередньо перед аналізом у проби вносили пропідій йодид для мічення ДНК з метою вилучення з аналізу агрегатів бактерій або клітин крові. Вимірювали відсоток фагоцитів, які поглинали бактерії та їхню активність (кількість бактерій на клітину). Додатково здійснювали візуалізацію фагоцитозу Е. coli нейтрофілами крові (рис. 1В) на лазерному скануючому конфокальному мікроскопі LSM 510 META (рис. 1Б). 2. Тест відновлення нітросинього тетразолію (НСТ-тест) Про функціональну активність гранулоцитів судили за поглинанням клітинами нітросинього тетразолію (НСТ) і відновленню його в диформазан, що виявляється у вигляді гранул синього кольору в цитоплазмі нейтрофілів. НСТ-тест проводили за методом М. Е. Віксмана і А. Н. Маянського. У пробірки з гепаринізованою венозною кров’ю (0,1 мл) додавали 0,1 мл 1% розчину НСТ в калій-фосфатному буфері ( рН 7,3). Реакційну суміш інкубували при 37ºС упродовж 30 хв. Після інкубації проводили гемоліз, додаючи спочатку 3 мл дистильованої H2O і після 35 секунд осмотичний тиск вирівнювали додаванням 1 мл 3,4% NaCl. Проби двічи відмивали в фосфатно-сольовому буфері (5мл) та центрифугували при 1500 об/хв упродовж 10 хв. Після цього осад ресуспендували у невеликій кількості буферу, готували мазок середньої щільності, висушували його при кімнатній температурі та фіксували в метиловому спирті (5 хв). Фарбування клітинних ядер здійснювали 0,1%-ним водним розчином метилового зеленого упродовж 10 хв. Після відмивки від барвника, зразки розглядали в світловому мікроскопі під імерсією. Серед ста клітин підраховували долю активних нейтрофілів, які містять гранули диформазану. Для визначення активності нейтрофільних гранулоцитів розраховували середній цитохімічний коефіцієнт (СЦК), а також оцінювали частку фагоцитуючих клітин. СЦК підраховували з урахуванням клітин з різним вмістом гранул диформазану за формулою: СЦК = (1А+2Б+3В+4Г)/100, де А - кількість клітин, у яких гранули диформазану займають 1/4 площі клітини; Б – 2/4 площі клітини; В – 3/4 площі клітини; Г – 4/4 площі клітини. Похибка вимірювання СЦК не перевищувала ± 4,7%. 3. Флюоресцентне визначення рівня утворення активних форм кисню та азоту з DCF-DA. Флюоресцентне визначення рівня утворення активних форм кисню та азоту проводили з DCF-DA ( 2`,7`-дихлорфлуоресцеїн диацетатом ). До 100 мкл свіжозібранної крові щурів додавали 1мкл р-ну DCF-DA і інкубували цільну кров 15 хв при 37ºС в темряві. Після інкубації пробу піддавали гемолізу, додаючи до неї спочатку 3 мл дистильованої H2O і після 35 секунд осмотичний тиск вирівнювали додаванням 1 мл 3,4% NaCl. Проби центифугували (1,5 тис. об / хв 10 хв), промивали 2 рази буфером (pH=7,4 ), і остаточний осад лейкоцитів ресуспендували у 0,5 мл буферного розчину. Одразу після приготування, проби аналізували на протоковому цитофлуориметрі COULTER EPICSTM XLTM. Гранулоцити та моноцити розрізняли, грунтуючись на відмінностях світлорозсіюючих властивостей цих клітин, які залежать від їхньої гранулярності. | |
| Просмотров: 445 | Загрузок: 11 | Рейтинг: 0.0/0 | |
| Всего комментариев: 0 | |