| Главная » Файлы » Курсовые работы » Курсовые проекты |
Alicyclobacillus acidocaldarius
| [ Скачать с сервера (1.16 Mb) ] | 09.07.2017, 15:07 |
| НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ ХАРЧОВИХ ТЕХНОЛОГІЙ Факультет Біотехнології та екологічного контролю Кафедра Біотехнології та мікробіології Дисципліна Основи наукових досліджень Курс ІІІ Група І Семестр 6 ЗАВДАННЯ на курсовий проект студентці Неймет Тамарі Андріївні 1.Тема проекту: Одержання целюлолітичних ферментів культивуванням Alicyclobacillus acidocaldarius 2. Термін здачі студенткою закінченого проекту « » 20 р. 3. Вихідні дані проекту 3.1 Представити структурну формулу сполуки; механізм дії на організм; описати зовнішній вигляд та фізико-хімічні властивості; основне призначення цільового продукту; методики контролю 3.2 Охарактеризувати морфологічні, культуральні, фізіолого-біохімічні властивості продуцента 3.3 Навести технологічні параметри біосинтезу лікопіну(фізико-хімічні параметри процесу) та схему його біосинтезу . 3.4 Основні стадії технологічного процесу – передферментаційні процеси (підготовка стерильного повітря, підготовка та стерилізація поживного середовища). Підготовка посівного матеріалу (2 етапи). Виробничий біосинтез 4. Зміст розрахунково-пояснювальної записки (перелік питань, що їх належить розробити) Вступ. Аналітичний огляд літератури. Значення целюлаз у життєдіяльності людини. Шляхи синтезу цільового продукту. Характеристика цільового продукту біосинтезу – целюлазного комплексу. Обгрунтування вибору технологічної схеми. Обгрунтування вибору біологічного агента. Характеристика біологічного агенту. Контроль виробництва 4.2 Провести розрахунок складу поживного середовища для виробничого біосинтезу, використовуючи як основне джерело вуглецю ксилан, як джерело азоту – хлорид амонію. Склад поживного середовища для одержання посівного матеріалу (глюкоза , дріжджовий екстракт, (NH4)2SO4 , MgSO4•7H2O, CaCl2•2H2O – 0,25, KH2PO4 , ZnSO4•7H2O , MnCl2•4H2O, H3BO3 , CoCl2•6H2O, CuCl2•2H2O, NiCl2•6H2O, Na2MoO4•2H2O – 0,03) 4.3 Передбачити приготування компонентів поживного середовища безпосередньо у ферментері 5. Перелік графічного матеріалу: Технологічна схема. 1 лист формату А2 6. Дата видачі завдання « » 2013р. ЗМІСТ Реферат……………………………………………………………………………… 4 Вступ………………………………………………………………………………… 5 Розділ 1. Аналітичний огляд літератури………………………………………….. 7 1.1. Характеристика целюлолітичних ферментів………………………………… 7 1.2. Ферментний комплекс A. acidocaldarius……………………………………… 8 1.3. Потреби промисловості у термоацидостабільних целюлазах………………. 10 1.4. Порівняльна характеристика методів одержання целюлаз………………….. 11 1.5. Біохімічні основи синтезу целюлаз за допомогою A. acidocaldarius……….. 12 1.6. Вплив основних факторів і параметрів на хід технологічного процесу……. 12 Розділ 2. Характеристика кінцевої продукції виробництва……………………… 12 2.1. Загальна характеристика целюлолітичного комплексу A. acidocaldarius….. 12 2.2. Галузі використання цільового продукту…………………………………….. 15 Розділ 3. Вибір технології………………………………………………………….. 19 Розділ 4. Обгрунтування вибору біологічного агента……………………………. 20 Розділ 5. Обгрунтування вибору складу поживного середовища………………. 23 Розділ 6. Розрахунок складу поживного середовища…………………………….. 26 Розділ 7. Обгрунтування способу проведення біосинтезу………………………. 30 Розділ 8. Обгрунтування вибору ферментера…………………………………….. 31 Розділ 9. Характеристика біологічного агента……………………………………. 35 9.1. Морфолого-культуральні ознаки……………………………………………… 35 9.2. Фізіолого-біохімічні ознаки…………………………………………………… 36 9.3. Таксономічний статус…………………………………………………………. 37 Розділ 10. Схема біосинтезу цільового продукту………………………………… 39 Розділ 11. Опис технологічної схеми……………………………………………… 41 Розділ 12. Контроль виробництва…………………………………………………. 48 12.1. Карта постадійного контролю………………………………………………. 48 12.2. Методи контролю…………………………………………………………….. 53 Список використаної літератури…………………………………………………... 54 РЕФЕРАТ Робота висвітлює найважливіші аспекти технології одержання целюлолітичних ферментів культивуванням Alicyclobacillus acidocaldarius. Проаналізовано особливості продуцента, параметри його вирощування, визначено оптимальний склад поживного середовища для підготовки посівного матеріалу та виробничого біосинтезу ферментів. Складено схему шляхів біосинтезу цільового продукту та технологічну схему отримання целюлаз. Внесено наступні пропозиції щодо вдосконалення існуючої лабораторної технології: знизити вартість процесу шляхом виключення стадій стерилізації обладнання, комунікацій та середовищ, оскільки умови вирощування продуцента запобігають траповій ферментації; підвищити концентрацію субстрату з метою збільшення виходу ферментного комплексу; використати для вирощування посівного матеріалу середовище на глюкозі для зменшення його вартості. Кількість сторінок: 61 Кількість рисунків: 9. Кількість таблиць: 4. Кількість бібліографічних найменувань: 60. Також робота містить 2 аркуші графічної частини формату А2. ВСТУП Целюлозовмісні субстрати – рослинна біомаса, макулатура, силосні корми – є важливою сировиною багатьох виробництв. Більшість із них пов’язана із розкладанням целюлози до мономерів. Так, наприклад, виробництво біоетанолу включає стадію доферментаційної підготовки рослинної сировини, яка для успішної біоконверсії повинна бути деполімеризована до моно- та олігосахаридів [1, 2, 3]. Фізико-хімічний гідроліз целюлози є енергозатратним, а тому економічно невигідним процесом. Більш того, нерідко він призводить до утворення екологічно небезпечних відходів. Тому перспективним напрямом вдосконалення технології є використання ферментативного гідролізу, для чого застосовуються целюлолітичні ферменти [1, 4, 5]. Целюлаза (β-D-глюканаза) – це комплекс індуцибельних ферментів, що синтезуються багатьма видами бактерій і грибів. Їх спільна дія приводить до розкладання целюлози та, у деяких випадках, її похідних (геміцелюлози, лігноцелюлози тощо) [6, 7, 8]. Субстратна специфічність целюлюлітичного комплексу залежить від його якісного складу, а той, у свою чергу – від організму, який продукує конкретний комплекс. Головним напрямком розробок в області целюлолітичних ферментних препаратів є пошук або створення мікроорганізмів, здатних синтезувати ферменти із заданими властивостями (температурним та рН-оптимумом дії, звуженою/розширеною субстратною специфічністю). Це зумовлено великою кількістю технологій з використанням біокаталізу целюлози та її похідних. Умови протікання процесу на кожному з виробництв різняться як за фізико-хімічними параметрами, так і за використовуваною сировиною, тому практично для кожного з них потрібен свій целюлолітичний комплекс [4, 5]. Термоацидостабільних целюлаз потребують такі великі галузі промисловості, як сільське господарство, виробництво екологічно чистого біопального, паперова індустрія і т.д. [5, 7, 9]. Отже, целюлазні ферменти є необхідним продуктом біотехнології. Світова промисловість випускає тисячі тонн таких препаратів. Найпопулярнішим промисловим продуцентом є мікроміцет Trichoderma reesei. Однак цей гриб є мезофільним, і його ферменти, відповідно, мають оптимум дії в області помірних температур та нейтрального рН; тоді як з наведених прикладів очевидно, що багато технологій вимагають термо- та кислотостійкості. До того ж, міцеліальний характер росту T. reesei обмежує його придатність для безперервного автоматизованого культивування [10]. Одними з перспективних продуцентів термоацидотолерантних целюлаз є бактерії Alicyclobacillus acidocaldarius. Вони синтезують складний целюлолітичний комплекс, ферменти якого не втрачають активності при нагріванні до 80 oC та рН<2 [11, 12]. Сам продуцент також є термоацидофільним, що зменшує ймовірність контамінації під час його культивування. Використання A. acidocaldarius дозволить значно здешевити виробництво та ефективніше використовувати ресурси. Однак на сьогоднішній день промислова технологія виробництва целюлолітичних ферментів за допомогою A. acidocaldarius знаходиться на етапі розробки. Тому актуальним є вивчення і аналіз існуючих підходів до виробничого процесу, метою яких є дана робота. РОЗДІЛ 1. АНАЛІТИЧНИЙ ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ 1.1. Характеристика целюлолітичних ферментів Целюлаза являє собою комплекс гідролітичних ферментів, спільна дія яких розкладає целюлозу до мономеру – β-глюкози. В окремих випадках вони можуть також гідролізувати похідні целюлози – карбоксиметилцелюлозу, геміцелюлозу, лігноцелюлозу тощо [13]. Інтерес до термоацидостабільних целюлаз проявився у другій половині ХХ ст. з розвитком технологій переробки целюлозовмісних субстратів. Практично всі вони проводяться за досить високих температур і тисків та низького рН [14, 3, 5]. Навіть використання целюлолітичних ферментів не дозволяє проводити процес за звичайних фізіологічних значень цих параметрів, хоч і значно знижує їх (зокрема, температуру – від 220-250 оС до 60-70 оС). Однак при цьому існуючі ферментні препарати досить швидко інактивуються, оскільки мають мезофільні характеристики [6]. Ще одією перевагою ферментативного каталізу є те, що він значно підвищує результучий вихід моно- та олігоцукрів [6]. Тому, очевидно, відмовлятися від нього як від технологічного прийому нераціонально. Натомість способом вирішення проблеми інактивації стали термоацидостабільні целюлази. Спочатку продуцентів подібних ферментів намагалися знайти серед мікрофлори шлунка жуйних тварин, оскільки було відомо, що саме вона відповідає за розкладання целюлози у рослинній біомасі-кормі [15]. Однак такі мікроорганізми не знайшли широкого промислового застосування через низький вихід продукту. Тоді увага дослідників звернулася до організмів, які у природі досить часто розкладають целюлозовмісні субстрати – грибів-мікроміцетів. Перший термостабільний препарат целюлолітичних ферментів було запатентовано у 1966 р., як продуцент використовувались гриби роду Rhizopus [16]. Гриби зазвичай менш термостабільні, ніж бактерії, і тому продукують ферменти з нижчим температурним оптимумом. Ацидостабільні целюлази грибного походження – взагалі рідкісне явище [17]. Крім того, у грибних целюлолітичних препаратів є значний недолік відносно гідролізу рослинної біомаси: через відсутність або малу кількість у комплексі геміцелюлаз вони не здатні ефективно розкладати рештки рослин без попередньої обробки останніх. Причини такої ситуації наступні. Біомаса рослин складається з чотирьох основних компонентів: целюлози, геміцелюлози, лігніну та пектину; разом вони називаються лігноцелюлозою [18]. Структурне взаєморозміщення цих чотирьох компонентів у клітинній стінці рослин наступне: целюлозні волокна пронизують та укріплюють матрицю з геміцелюлози і лігніну або пектину [19, 20]. Кристалічність целюлози, гідрофобність лігніну та інкапсульованість целюлози всередині лігнін-геміцелюлозної матриці є основними факторами, що визначають стійкість лігноцелюлозних матеріалів до біологічного руйнування [21]. Щоб отримати доступ до целюлози, потрібно спочатку зруйнувати всі супутні їй сполуки, а грибний ферментний комплекс, як вказано вище, на це не здатен через відсутність потрібних ферментів. Бактеріальні целюлолітичні комплекси позбавлені цих недоліків. [21]. З цих причин пошук нових продуцентів целюлаз нині найчастіше проводиться серед бактерій та архей-екстремофілів [22]. 1.2. Ферментний комплекс A. acidocaldarius Вивчення целюлолітичних властивостей A. acidocaldarius проводиться з 80-х рр. ХХ ст. [23]. Станом на 2012 р. у A.acidocaldarius ідентифіковано наступні термоацидостабільні ферменти целюлазного комплексу: [6] - 1,4-β-D-глюкан-4-глюканогідролаза (ендоглюканаза); - целобіогідролаза; - целобіозофосфорилаза; - α-глюкозидаза; - β-глюкозидаза; - α-галактозидаза; - β-галактозидаза; - β-1,4-ксиланаза; - α-ксилозидаза; - α-L-арабінофуранозидаза. Промислове значення можуть мати наступні ферменти: 1) ендоглюканаза CelA Оптимум дії 70 оС, рН=5,5; не виділяється в культуральну рідину. Стабільна при зберіганні в буферному розчині за 4 оС, зберігає 50% активності при нагріванні до 80 оС. Специфічна до β-1,4-глюканів [24]. 2) ендоглюканаза Cel9A Оптимум дії такий же, як і в попереднього ферменту. Однак, на відміну від нього, діє і на β-1,4-ксилани [25]. 3) ендоглюканаза CelВ Оптимум дії 80 оС, рН=4; деякий час не втрачає активності при температурах від 40 до 100 оС та значеннях рН від 3 до 5. Специфічна до глюканів та ксиланів. Легко виділяється з клітин екстрактивними методами [12]. 4) β-1,4-глюканаза CelA4 Оптимум дії 65 оС, рН=2,6. Має широку субстратну специфічність, протеазорезистентна, більш стабільна, ніж існуючі препарати подібних ферментів [11]. 5) целюлаза CelG Оптимум дії 65 оС, рН=4 [26]. 6) β-глюкозидаза Оптимум дії 85 оС, рН=5,5. Не втрачає активності при температурі 65 оС (хоча при 80 та 90 оС деактивується практично відразу) та значеннях рН від 4 до 6. Субстратна специфічність широка: фермент виявляє активність до β-D-глюко-, -галакто- та фукозидів, глюкозодисахаридів (целобіози, гентіобіози), здатен досить ефективно розкладати лактозу [27]. 1.3. Потреби промисловості у термоацидостабільних целюлазах Ферментні комплекси целюлолітичного характеру застосовуються у багатьох галузях сучасної промисловості. Найважливіші з них наведено нижче. Виробництво біопалива. Одним з найперспективніших рідких паливних матеріалів є біоетанол. Промислова біоконверсія рослинної сировини до етанолу включає два основних етапи: 1) гідроліз целюлози до розчинних редукуючих цукрів, які можуть споживатися мікроорганізмами під час спиртового бродіння; 2) ферментація за участі дріжджів або бактерій [1, 13]. Як уже зазначалося, фізико-хімічний гідроліз проходить за високих температур і тисків, а відповідно, потребує значних затрат енергії і матеріалів. При використанні лугів або кислот в якості гідролітичних агентів утворюється велика кількість екологічно небезпечних відходів. До того ж, за таких жорстких умов неминуче відбувається деградація частини гексоз та пентоз, що утворилися з целюлози. Використання целюлолітичних ферментів дає змогу практично повністю усунути ці недоліки, проводячи процес за помірних умов (to=45-50oC, рН=4-6). Щоправда, навіть при такому нагріванні активність целюлаз, одержаних за допомогою мезофільних мікроорганізмів, зменшується або втрачається. Тому при пошуку нових ферментних препаратів варто орієнтуватися на їх стійкість до підвищених температур та кислого рН [6]. Виробництво кормів для сільськогосподарських тварин. Рослинні корми, хоч і є природною їжею жуйних тварин (корів, свиней тощо), не засвоюються ними у повному обсязі, оскільки тварини не здатні розкладати целюлозу – це робить мікрофлора їхнього шлунка. Якщо обробити корм целюлозолітичними ферментами, здатними діяти в умовах підвищеної кислотності та температури шлунка, то біодоступність їжі підвищиться – а отже, відгодівля буде ефективнішою [11]. Целюлозно-паперова індустрія. Виготовлення паперової пульпи біомеханічним методом з використанням ферментів дає можливість зберегти 20–40% енергії порівняно з механічним. При переробці макулатури відбілення кислотостійкими целюлазами зменшує або зовсім нівелює кількість екологічно небезпечних лужних відходів, зберігає міцність та яскравість волокон [9]. Текстильна промисловість. Традиційним етапом обробки джинсових, бавовняних та інших целюлозовмісних тканин є полірування. Воно робить тканини більш м’якими, гладенькими та покращує їх зовнішній вигляд завдяки згладжуванню поверхневих волокон. Застосування кислотостійких целюлаз у цьому процесі дозволяє зменшити кількість відходів та підвищити якість тканин [9]. Харчова промисловість. Тут целюлази знаходять дуже широке застосування – у виробництві хліба, при кларифікації та мацерації соків, у виноробстві та пивоварінні. Вони дають змогу ефективніше використовувати рослинну сировину – зернові, фрукти, ягоди; підвищують якість готового продукту – наприклад, пористість хліба, прозорість соків та вина тощо. Але, оскільки харчові технології нерідко пов’язані з термічною обробкою продукту (хлібопекарство, пивоваріння), а самі продукти мають підвищену кислотність (соки), то ферменти повинні бути стійкими до таких умов [9]. 1.4. Порівняльна характеристика методів одержання целюлаз Целюлолітичні ферменти в природі синтезуються лише мікроорганізмами (грибами, бактеріями, археями) [28]. Хімічний синтез ферментів твердофазним методом синтезу білка Мерріфілда [29] неможливо здійснити у промислових масштабах, оскільки це дуже складні білкові молекули; велика кількість стадій та реагентів робить процес економічно невигідним. Тому біотехнологія є практично єдиним способом виготовлення таких препаратів. Біотехнологічний синтез можна здійснювати двома способами – глибинним та поверхневим. Грибні продуценти целюлаз вимагають останнього способу култивування, але він погано автоматизується. Бактеріальні, навпаки, дозволяють застосувати глибинний спосіб [30]. A. acidocaldarius планується вирощувати саме глибинним культивуванням. 1.5. Біохімічні основи синтезу целюлаз за допомогою A. acidocaldarius Целюлази є вторинним метаболітом, тому потребують певного індуктора для надсинтезу [31]. Найчастіше ним є целюлоза [32] або ксилан [33]. Показано, що целюлозні субстрати можуть бути не тільки індуктором синтезу ферментів, а й джерелом вуглецю [4]. Найбільш повно дослідженим на сьогодні є процес з використанням ксилану як ростового субстрату та індуктора синтезу целюлаз [33]. Можна припустити наступні етапи конверсії ксилану до целюлаз: 1) гідроліз ксилану до ксилози; 2) катаболізм ксилози до проміжних продуктів біосинтезу амінокислот – пірувату, фосфоенолпірувату, 2-оксоглутарату, оксалоацетату, фосфогліцерату, еритрозо-4-фосфату та фосфорибозилпірофосфату; 3) синтез амінокислот, що входять до складу ферментних білків; 4) синтез білка за рибосомальним механізмом. 1.6. Вплив основних факторів і параметрів на хід технологічного процесу Температура, рН. Виходячи з фізіологічних особливостей продуцента (оптимум росту – 55-60 оС, рН 3,0-4,0) [34], можна припустити, що зниження температури нижче 50 оС та рН нижче 3 буде спостерігатися зниження виходу цільового продукту, оскільки метаболізм клітини буде спрямований на виживання за несприятливих умов, а не на надсинтез целюлаз. Підвищення температури та рН вище значень 70 оС та 6 відповідно призведе до загибелі біологічного агента. Концентрація субстрату. Дослідження росту продуцента на ксилані [33] виявили, що для успішного біосинтезу целюлаз його концентрація повинна бути не менше ніж 1 г/л. Можна припустити, що ці дані проектуються і на чисту целюлозу. Однак якщо в результаті гідролізу субстрату в великих кількостях утворюється глюкоза, то синтез цільового продукту гальмується нею [31]. Тому необхідно вчасно відводити невикористані продукти гідролізу. Контамінація. Завдяки доволі жорстким умовам культивування ризик контамінації процесу сильно знижується, тому гіпотетично його можна проводити в нестерильних умовах [35]. РОЗДІЛ 2. ХАРАКТЕРИСТИКА КІНЦЕВОЇ ПРОДУКЦІЇ ВИРОБНИЦТВА 2.1. Загальна характеристика целюлолітичного комплексу A. acidocaldarius Целюлаза – це комплекс гідролітичних ферментів, спільна дія яких розкладає целюлозу до мономеру – β-глюкози. В окремих випадках вони можуть також гідролізувати похідні целюлози – карбоксиметилцелюлозу, геміцелюлозу, лігноцелюлозу тощо [13, 21]. Головними ферментами комплексу є: 1) екзоцелюлази – гідролізують нерозчинні целюлозні субстрати з невпорядкованим β-1,4-зв’язків у молекулі целюлози; 2) ендоцелюлази – гідролізують розчинні целюлозні субстрати з розривом β-1,4-зв’язків у будь-якому місці полімерного ланцюга; 3) β-глюкозидази, целобіази – гідролізують целобіозу та інші β-глюкозиди [36, 37]. Станом на 2012 р. у A. acidocaldarius ідентифіковано наступні термоацидостабільні ферменти целюлазного комплексу: [6] - 1,4-β-D-глюкан-4-глюканогідролаза (ендоглюканаза); - целобіогідролаза; - целобіозофосфорилаза; - α-глюкозидаза; - β-глюкозидаза; - α-галактозидаза; - β-галактозидаза; - β-1,4-ксиланаза; - α-ксилозидаза; - α-L-арабінофуранозидаза; - цинамоїлестергідролаза. Промислове значення мають наступні ф | |
| Просмотров: 649 | Загрузок: 36 | Рейтинг: 0.0/0 | |
| Всего комментариев: 0 | |